Главная


http://medtehnic.ru/glavnaya/lechebnie-vorotniki-i-poyasa/lechebniy-vorotnik-1.html - MedTehnic.ru

Современная иммунохимия

Классические методы иммунохимического анализа, описанные ещё в конце XIX веке в работах таких выдающихся учёных как Эрлих, Борде, Ландштейнера основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и, кроме того, в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гаптенов), например гормонов, лекарственных соединений, эти методы непригодны.

Индикация образовавшегося комплекса антиген - антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.

Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченых реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры - от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток.

Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I , в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон (Yalow and Berson) в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии. Существуют разные варианты радиоиммуноанализа. Так, например, Майлес и Халес (Miles and Hales) в 1968 году использовали йодированные антитела в комбинации с антигеном на твёрдой фазе. В1978 году Лангон (Langone) предложил метить йодом белок А, который способен специфично связываться с Fc фрагментами антител. Таким образом, меченый белок А можно использовать как универсальный реагент. В 1979 Вейлером и Зенком(Weiler and Zenk) был предложен авторадиографический РИА, в котором они использовали мультиканальные плашки. Кроме того, в 1981 Аксельсон с коллегами(Axelson) разработали липосомный иммуноанализ, где антиген включался в меченые йодом липидные визикулы, которые затем могли быть осаждены антителами.

Наряду с несомненными достоинствами РИА имеет и определённые недостатки, к которым можно отнести следующие:
1) ограниченный срок жизни радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов;
2) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности;
3) возможность радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, что вызывает необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала.
Именно эти трудности послужили исходным моментом для поиска методов, альтернативных РИА, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и экспрессность.

В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10-12 М и ниже). На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Энгвал и Перлман (Е. Engvall и P. Perlmann) для IgG фракции, Ван Веемен и Шурс (К Van Weemen и A. Schuurs) для эстрогенов (1971).
Эти методы наиболее распространенные и используются для определения широкого круга как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных соединений - антител, пептидных и стероидных гормонов, фармакологических препаратов, вирусных и бактериальных антигенов, пестицидов и т. д.

В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.

Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.

Внедрение гомогенного мультиканального варианта ИФА, получившего название EMIT-анализа (Энгвал, 1980), в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов количественного определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях, что дало возможность изучить их фармакокинетику и метаболизм в организме. Большим преимуществом метода EMIT-анализа является возможность использования малых объемов анализируемого образца (5-50 мкл) и отсутствие стадии его предварительной обработки.

Развитие гомогенного ИФА начиналось с разработки методов определения низкомолекулярных соединений, затем появились новые модификации, позволяющие определять и высокомолекулярные антигены - альбумин, иммуноглобулины и т. д.

Ещё один вариант иммуноанализа – флуоресцентный иммуноанализ (ФИА) c использование флуоресцентных меток. Впервые такой анализ провели Смит и Хеммина (Smith, 1981 and Hemmina, 1984). Потенциальная чувствительность флуорсцентных методов очень высока, но на практике она лимитируется сигналом фона, который может возникать из-за присутствия в растворе других флуорофоров. Существует огромное количество разновидностей ФИА – как гомогенных, так и гетерогенных.
Наиболее удобным из гомегенных флуоресцентных методов оказался поляризационный ФИА, основанный на измерении поляризации флуоресценции. Так, после первых работ Вебера (Weber, 1952), применение поляризации флуоресценции для изучения биологических систем стало быстро внедрятся в иммуноанализ. Впервые поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) был описан в работах Дандликера и Спесера (Dandliker and Spencer, 1973). Основан он на конкуренции определяемого антигена и антигена, меченого флуоресцентной меткой за ограниченое число центров связывания специфических антител и измерении степени поляризации флуоресценции реакционной смеси. Первым клиническим применением ПФИА было измерение гентамицина (Watson, 1976). В качестве метки использовался флуоресцеин изотиокарбонат (FITC). Кроме флуоресцентных существуют ещё био- и хемилюминисцентные методы (Velan and Haimann, 1978).

Широкие возможности в ИФА открывает использование моноклональных антител, специфичных строго к определенному антигенному участку анализируемого соединения (1976 г. Kohler and Milstein, Нобелевская премия за получение моноклональных антител in vitro). Надо также отметить работы Лайнуса Полинга (1-я пол. XX в., США), которому удалось получить искусственные антитела. Кроме того, он сформулировал постулат о комплементарности трёхмерной структуры антигена и антитела (1942).
Путем подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные иммунохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга.

Метод иммуноанализа находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИА.