Главная


http://logki.net/glavnaya/stolovie-pribori/nabor-mernich-lozhek-wallman.html - logki.net

Оценка метода

Локальный гемолиз (стандартная методика) в отличие от других методов позволяет обнаруживать и количественно определять единичные антителообразующие клетки среди нескольких миллионов клеток в течение 2 часов. Существенное значение для успеха эксперимента имеет выбор агара. Оптимальным следует считать формирование верхнего и нижнего слоя геля на агарозы, т. к. агароза не инактивирует комплемент. При использовании чистого агара возникает необходимость внесения ДЭАЭ-декстрана. Этот поликатион адсорбирует сульфополисахариды, выделяющиеся при кипячении агара, которые связывают ионы Са2+ и Mg2+. Именно образованием сульфополисахаридов обусловлено ингибирующее действие агара на комплемент. Колебания концентрации агара в пределах 0,4—1% не влияют на число зон гемолиза и их диаметр. Повышение концентрации свыше 1 % снижает число зон гемолиза и уменьшает их размеры. Для локального гемолиза лучше всего использовать эритроциты барана, хранившиеся в течение 1—3 недели в растворе Олевера.

Свежие эритроциты малочувствительны к иммуногемолизу; длительно хранившиеся клетки, напротив, чрезмерно хрупки. Следует всегда помнить об генетически обусловленной различной чувствительности эритроцитов разных особей. Поэтому желательно всегда использовать эритроциты одного и того же животного. При меньшей концентрации эритроцитов барана образуются зоны гемолиза большего размера, причем их число не уменьшается. Однако при рекомендованных нами концентрациях достигается большая надежность результатов, особенно если эритроциты барана отличаются повышенной хрупкостью. Температура 47—49 °С не влияет на индикаторные эритроциты, но лишает лейкоциты жизнеспособности. В связи с этим смешивание лимфоидных клеток с расплавленной агарозой представляет собой самую тонкую операцию при постановке локального гемолиза. Оно должно проводиться почти одновременно с распределением цитосодержащего золя по поверхности нижнего слоя стереотипными, отработанными движениями рук.

Удлинение периода инкубации перед внесением комплемента не оказывает влияния на размер и величину зон гемолиза. Температура инкубации менее 37 °С приводит к снижению зон гемолиза. В качестве источника комплемента чаще всего используют сыворотку морской свинки, адсорбированную ЭБ; этот препарат дает наилучшие результаты с мышиными антител к эритроцитам барана. Если иммунизируют другие виды животных различными эритроцитами, то следует также подбирать подходящие сыворотки различных животных в качестве источника комплемента с целью получения оптимальных результатов. Зоны локального гемолиза, образующиеся до внесения комплемента и не содержащие в центре клетки с ядром, — ложные и исключаются при подсчете результатов.

Причиной образования ложных зон локального гемолиза могут служить трещины или нерастворившиеся кусочки агара, дегенерировавшие клетки или агрегаты клеток, колонии гемолитических бактерий в редких случаях клетки донора эритроцитов, образующие гемолизины. Еще одной причиной образования ложных зон локального гемолиза может стать перенос пассивно адсорбированных антител, о возможности которого всегда необходимо помнить.

Существуют методы непосредственного определения и подсчета так называемых непрямых, т. е. He-IgM-продуцирующих антителообразующие клетки. Эти методы свободны от неопределенностей конвенциональных методов, в которых подсчет нe-IgM-продуцирующих антителообразующие клетки основан на учете разности количества зон локального гемолиза наблюдаемых прямым и непрямым методом. Даже при оптимальном разведении питательной среды вследствие анти-Fab-активности ПС, учитывая неодинаковое торможение образование IgM-зависимых зон локального гемолиза, эти методы приводят к заниженным оценкам непрямых антителообразующих клеток. Элиминация IgM-зависимых зон локального гемолиза не только снижает затраты времени (2-кратный подсчет зон локального гемолиза), но, что еще более важно, исключает стадию проявления непрямых IgM-образующих клеток полиспецифической анти-IgM сывороткой.

При наличии моноспецифических АС можно определять различные алло- и изотипы иммуноглобулинов в реакции непрямого локального гемолиза. Наиболее прост, экономичен и чувствителен безгелевый метод. Он особенно удобен при микроманипуляциях и морфологическом исследовании отдельных живых антителообразующих клеток Высокая чувствительность метода обусловлена ограниченной диффузией антител в монослое индикаторных эритроцитов барана; лизис даже 7 отдельных эритроцитов приводит к появлению заметной зоны гемолиза. Этим обусловлен и больший диаметр зон локального гемолиза, чем тот, который наблюдается при работе с гелем. Недостатком безгелевого метода является необходимость подсчета зон гемолиза в течение нескольких часрв и невозможность фиксации препарата.

Можно исследовать лишь ограниченное число лимфоидных клеток. При концентрации лимфоцитов 5х107/мл большая часть зон локального гемолиза маскируется автологичными эритроцитами и лейкоцитами. Этих недостатков лишен модифицированный метод, при котором монослой индикаторных эритроцитов связан с поверхностью пластика. Предложено много вариантов постановки реакции локального гемолиза, важнейшие из них перечислены в табл. 5. Часто вместо геля агара или агарозы применяют полутвердые субстанции, например, карбоксиметиллюлозу (КМ) в закрытых или открытых системах. Системы с КМ-целлюлозой пригодны не столько для рутинных работ, сколько для наблюдения за АОК в течение длительных периодов, так как известно, что КМ-целлюлоза создает оптимальные условия для выживания клеток. Многие авторы отказываются от чашек Петри, распределяя смесь золя агарозы с клетками по поверхности предметного стекла с преформированным слоем 0,1—0,2% агарозы. Эта модификация особенно удобна при работе с моноспецифическими сыворотками и небольшими количествами конъюгированных с различными веществами эритроцитов. Она непригодна для работы с большими количествами лимфоцитов ввиду многочисленности зон локального гемолиза.

Сверхтонкий слой агара на предметных стеклах особенно удобно применять для цитологических и авторадиографических исследований. Микромодификация локального гемолиза позволяет проводить прямое исследование культур В-лимфоцитов в микропланшетах. Пассивный локальный гемолиз представляет собой довольно тонкий метод, применение которого требует от экспериментатора большого мастерства. Условия конъюгирования, при которых получают оптимальную поверхностную плотность детерминант на эритроцитах, как правило, подбираются экспериментально. Методы конъюгирования, описанные для РПГА, не пригодны для реакции локального гемолиза, поскольку эритроциты, подготовленные для гемагглютинации, содержат очень мало детерминант для того, чтобы после наслоения антител и комплемента образовались зоны локального гемолиза. Развитие локального гемолиза в геле зависит от изотипа и аффинности выделяемых АОК антител. Заниженное число антителообразующих клеток в реакции пассивного локального гемолиза обусловлено неадекватной конъюгацией эритроцитов.

Специфичность локального гемолиза можно повысить, тормозя реакцию введением в агар свободного антигена или гаптена. Таким же путем можно оценивать авидность секретируемых антителообразующие клетки антител. Этот метод основан на известном факте избирательного торможения малыми концентрациями свободного антигена и гаптена локального гемолиза, обусловленного высокоавидными антителами, по сравнению с локальным гемолизом, обусловленным низкоавидными антителами. Для статистической обработки результатов локального гемолиза в геле рекомендуется представлять данные в виде десятичных логарифмов, что позволяет получить распределение отдельных результатов в выборке, приближающееся к биноминальному.

Ошибка метода локального гемолиза составляет около 15%. Колебания, обусловленные качеством материала, полученного от животных, существенно выше, коэффициент вариации в данном случае может достигать 0,5. Локальный гемолиз имеет важное значение для фундаментальных иммунологических исследований. Благодаря этому методу были получены весьма существенные результаты в области исследования регуляции гуморального иммунитета и изучения структуры и жизнедеятельности антителообразующие клетки in vivo и in vitro. В качестве примера на рисунке представлена кинетика первичного и вторичного иммунного ответа мыши, выражающаяся в изменении количества антителообразующих клеток в селезенке.

Образование антителообразующих клеток в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана, в ходе первичного (1) и вторичного (2, 3) иммунного ответа

Образование антителообразующих клеток в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана

1, 2 —прямые АОК (IgM);
3 — непрямые АОК (не IgM).

Локальный гемолиз уже в течение некоторого времени используется в клинике, в частности при исследовании периферической крови пациентов с различными заболеваниями иммунной системы. Определяют, в частности, способность В-лимфоцитов к образованию специфических ИГ, а также контроль активности лимфоцитов со стороны регуляторных клеток.