Главная


aebox нас любят люди

Применение агрегированного нагреванием IgG человека в качестве стандарта

Оценка чувствительности методов обнаружения иммунных комплексов, как правило, связана с применением стандарта по Ig человека. По таким показателям, как активация комплемента, связывание с макрофагами и способность индуцировать феномен Артюса, Ig человека сходен с растворимыми иммунных комплексов. Применяя растворимые иммунные комплексы, можно стандартизовать различные тест-системы на иммунные комплексы и выражать получаемые значения в эквивалентах Ig человека. Имеются работы, посвященные изучению его характеристик и стабильности. Ультрацентрифугированием агрегированного при 63 °С IgG человека было показано, что степень агрегации зависит от продолжительности тепловой обработки.

Седиментационный профиль агрегированного глобулина

Седиментационный профиль агрегированного глобулина

IgG человека инкубировали при 63 "С в течение 10 мни (1); 20 мии (2); 30 мни (3): контроль (4).
После удаления нерастворимых агрегатов препараты фракционировали методом зонального центрифугирования при 263 000g
в течение 2 ч (ротор SW — 40Ti) в градиенте плотности сахарозы с добавлением БСА.

Усиление процесса агрегации наблюдалось после хранения при —70 °С. Введение 0,5%бычьий сывороточный альбуминзаметно тормозило этот процесс. Агрегаты Ig человека, состоящие из 48—80 молекул IgG, после хранения в течение 15 мес не изменяли своей способности активировать комплемент и связываться в двух других тестах при добавлении 0,5% БСА.

Приготовление Ig человека. Растворяют 20—50 мг мономерного человеческого IgG в 1 мл ФСБ и инкубируют 20 мин при 63 °С. Последующие операции проводят при 0— 4 °С. Легко седиментирующие агрегаты удаляют из опалесцирующего раствора центрифугированием в течение 15 мин при 3000 g. Термическая обработка переводит в агрегированную форму не более 50% исходного материала. Различные способы определения иммунных комплексов неодинаково зависят от размера частиц Ig человека или иммунных комплексов, поэтому построение стандартной кривой требует его фракционирования и удаления мономеров IgG. Для устранения нежелательных компонентов можно применять гель-фильтрацию через сефакрил S-200, сефарозу 4 В, и особенно тультрацентрифугирование Ig человека в градиенте плотности сахарозы 10—30%. В присутствии маркеров можно получать агрегаты вполне определенной величины. Градиент приготовляют на БСА-боратном буфере с рН 7,2 (0,1 М Н3В03, 0,14 М NaCl, 0,5% ВСА). К числу недостатков центрифугирования относится то, что выход Ig человека составляет не более 10 мг, кроме того, необходимо удалять сахарозу диализом.