Главная


курсы массажа

Анализ гаметного разнообразия F-областей L-цепей с помощью рекомбинантных ДНК

При скрининге геномных библиотек гаметной ДНК с помощью зондов, полученных из кДНК V-областей, в нескольких лабораториях были выделены клоны, содержащие группы родственных генов V для х- или Н-цепей. Достаточно часто встречались клоны, содержащие по 2 гомологичных гена V, расположенных на расстоянии 5—15 тпн друг от друга. Это позволило предположить, что гены V в геноме могут располагаться группами, состоящими из родственных последовательностей. Корреляция между результатами блоттинга по Саузерну геномной ДНК и рестрикционными картами клонированных генов указывала, что в ряде случае клоны эти содержат значительную часть V-семейства; это позволило надежно оценить размер нескольких V-семейств. Такого рода исследования показали, что геномный репертуар генов V заметно шире, чем минимальные оценки, предсказанные теми, кто считал соматические мутации основным источником разнообразия; тем не менее было твердо установлено, что соматические мутации играют в создании многообразия существенную роль.

Изучая локус Vx мыши, Кори и др. проанализировали картины блоттинга по Саузерну геномной ДНК мыши с использованием F-зондов, полученных из 10 различных клонов х-кДНК. Каждый из зондов при гибридизации давал характерную картину из 15—17 полос, но, поскольку некоторые зонды приводили к почти идентичным полосам, были выделены лишь четыре независимые типа гибридизации. Путем сложения длин интенсивно гибридизующихся фрагментов в каждом из этих случаев минимальная длина ДНК, соответствующая каждому из четырех семейств родственных генов V, была оценена примерно в 400 тпн. Для оценки общего геномного репертуара Vx была использована выборочная статистика с тремя различными системами экстраполяции, основанными на количестве полос, выявляемых при блоттинге по Саузерну; наиболее правильные оценки лежали в диапазоне от 90 до 320 генов.

Сходные эксперименты для гаметных генов Vx человека были проведены Бентли и Рэббитсом. Эти исследователи выявили меньший набор гаметных генов, согласующийся с меньшим числом групп родственных аминокислотных последовательностей, обнаруженных в миеломных х-цепях человека, — только 4 в отличие от более чем 30 у мыши. В этой работе для отбора генов из библиотеки ДНК печени человеческого эмбриона был использован Vx-зонд мыши. Удалось выделить три клона Vx человека, два из которых содержали гены, кодирующие V-области группы I. (Интересно, что третий клон содержал родственную им последовательность, деградировавшую до псевдогена вследствие замен, вставок и делеций, препятствующих функциональной экспрессии). Функциональные гены Vx были затем использованы в качестве зондов для блоттинга по Саузерну геномной ДНК человека. В результате удалось выявить семейство из 15— 20 гибридизующихся полос. Поскольку использование Vx-зонда мыши, дивергировавшего на 28% от зондов человека, приводило к той же картине гибридизации, а анализ аминокислотных последовательностей х-цепей группы I позволил предсказать, что максимальная дивергенция нуклеотидных последовательностей (между членами этой группы) составляет около 25%, был сделан вывод, что среди гибридизационных полос представлены все члены семейства генов Vx группы I. Однако, поскольку зонд мыши в равной степени гомологичен х-последовательностям групп I, III и IV человека, вполне вероятно, что наблюдающиеся 15—20 полос включают и гаметные гены V для этих групп. Предположение это было подтверждено результатами блоттинга по Саузерну с использованием зонда, соответствующего гену V группы III; если не считать различий в относительной интенсивности полос, наблюдавшаяся картина была почти неотличима от полученной с зондом группы I. Различия выявлялись лишь по трем полосам. Таким образом, наблюдавшиеся в этих экспериментах полосы могут соответствовать большей части генов Vx групп I, III и IV, которые вместе составляют 83% последовательностей секвенированных х-цепей человека. Меньшая величина гаметного репертуара у человека по сравнению с мышиным свидетельствует о более важной роли соматических мутаций в генах х человека, что может быть связано с большей продолжительностью его жизни.