Главная


dload кино

Серологическое определение антигенсвязывающих рецепторов Т-клеток

Как детально описали Витетта (Vitetta) и др., с помощью различных методов можно показать, что на поверхности В-клеток имеются молекулы иммуноглобулинов, специфически связывающие антиген, причем после активации эти клетки начинают секретировать молекулы иммуноглобулинов, способных связывать антиген точно так же, как и поверхностные иммуноглобулины предшественников этих антителообразующих клеток. Очевидно, что наличие такой предопределенности отражает существование уникальных перестроек генов Igh-V и Vили V-K в клетках-предшественниках. В ходе этих исследований весьма плодотворным оказалось изучение взаимодействия В-клеточных рецепторов не с антигеном, а с антителами против иммуноглобулинов. С помощью последних было показано, что у всех В- клеток антигенные детерминанты поверхностных иммуноглобулинов полностью сходны с детерминантами сывороточных иммуноглобулинов, что экспрессируемые В-клеткой изотипические или аллотипические маркеры совпадают по изотипу или аллотипу с синтезируемыми и секретируемыми в дальнейшем этой же клеткой иммуноглобулинами и что В-клетки, несущие данные идиотипические детерминанты, в дальнейшем синтезируют антитела того же самого идиотипа. Наконец, антитела против иммуноглобулинов часто использовались для эффективной стимуляции В-клеток к делению, индуцировавшей деление клеток (или) секрецию антител.

Поэтому многим исследователям представлялось очевидным, что использование антиидиотипических, антиаллотипических и антиизотипических антител, специфичных к антигенсвязывающим Т-клеточным молекулам, которые, возможно, аналогичны сывороточным иммуноглобулинам, могло бы облегчить изучение генетики и химии рецепторов Т-клеток. В первых исследованиях из соображений экономии были использованы антитела против иммуноглобулинов, поскольку казалось маловероятным, что в Т- и В-клетках для кодирования белков, специфичных к одним и тем же антигенам, могут существовать два различных сложных мультигенных семейства и, следовательно, Т-клетки для синтеза своих рецепторов должны использовать те же самые гены, что и В-клетки. Однако попытки продемонстрировать наличие на поверхности Т-клеток обычных иммуноглобулиновых детерминант, включая изотипические и аллотипические, закончились неудачей. Хотя в некоторых сообщениях и говорилось о существовании функциональной активности у анти-^-антисывороток, при этом, однако, не приводилось убедительных доказательств того, что данные эффекты обусловлены именно антителами против иммуноглобулинов, а не другими компонентами этих сложных сывороток. Имеется несколько сообщений о том, что подобные сыворотки действительно содержат антитела, реагирующие с Т-клеточными антигенсвязывающими молекулами. Однако детерминанты, о которых наверняка можно сказать, что они являются общими для антиген- связывающих молекул Т- и В-клеток, пока не известны. Кроме того, как было показано, результаты таких экспериментов в большой степени зависят от антисыворотки, выбранной для исследования, а это приводит к значительным противоречиям и обесценивает получаемую информацию.

Тем не менее один тип антисывороток, как оказалось, может быть весьма полезным при изучении Т-клеточных рецепторов. Сыворотки данного типа специфичны к идиотипическим детерминантам молекул сывороточных иммуноглобулинов. Антитела, содержащиеся в этих сыворотках, связываются также и с Т-клетками или с выделенными из них антигенсвязывающими молекулами. Два наблюдения делают эти данные особенно интересными. Первое заключается в том, что антиидиотипические антисыворотки реагируют с иммуноглобулинами, синтезированными в В-клетках, и с Т-клетками, специфичными к тем же антигенным детерминантам. Это может означать, что либо эти Т- и В-клеточные молекулы кодируются одними и теми же генами, либо существует несколько различных путей образования молекул, имеющих данную антигенную детерминанту; структурное сходство этих молекул не позволяет антиидиотипическим антителам отличать их друг от друга. Что такие молекулы закодированы в одном блоке генов, можно предположить, исходя из данных по изучению конгенных и реком- бинантных мышей и крыс, у которых идиотипические детерминанты Т-клеток кодируются генами Igh-V, ответственными за экспрессию идиотипических детерминант В-клеточных иммуноглобулинов с такой же специфичностью.

Эти результаты, хотя и получены в нескольких лабораториях и при использовании Т-клеток нескольких различных типов, все же не доказывают окончательно, что Т- и В-клетки для кодирования своих антигенсвязывающих рецепторов используют одни и те же гены Igh-V, а лишь указывают на возможную роль сегмента хромосомы 12 мыши, в котором расположены гень!, кодирующие эти детерминанты. Однако тот факт, что не удается обнаружить изменений в участке Igh ДНК Т-клеток, аналогичных изменениям, происходящим в участке Igh ДНК В-клеток, навело многих исследователей на мысль о том, что наблюдаемую идентичность идиотипических детерминант Т- и В-лимфоцитов можно, по-видимому, объяснить иначе.

Еще один подход связан с использованием антител, специфических к отдельным частям структуры VH, общим для многих антител. Такие антитела к каркасной части VH, как показал ряд экспериментов, реагируют с Т-клетка- ми. И хотя иммуногистохимическими методами часто не удается выявить это взаимодействие, тем не менее было обнаружено, что данные антитела препятствуют связыванию антигена Т-клетками, обработанными IL-1, в опытах in vitro блокируют хелперную функцию Т- клеток, реагируют с Т-клеточными антигенсвязывающими белками, выделенными из гаптенсвязывающих Т-клеток, а также связываются с факторами индукции и супрессии из Т-клеточных гибридов. В одной из работ было продемонстрировано, что свойства различных Т-кле- ток, проявляющиеся при их взаимодействии с антителами к каркасной части VH, определяются генами Igh. Таким образом, эти результаты, так же как и результаты, полученные с помощью антиидиотипических антител, дают основание думать, что для кодирования антигенсвязывающих рецепторов Т- и В- клетками используется один и тот же пул генов lgh-V Попытки аналогичным образом обнаружить на поверхности Т-лимфоцитов детерминанты каркасной части VL привели к противоречивым результатам, так что в настоящее время нет надежных данных о том, принимают ли VL участие в образовании Т-клеточ- ных рецепторов или нет.

Из соображений здравого смысла и на основе цитированных выше данных, указывающих на роль генов иммуноглобулинов в формировании Т-клеточных рецепторов, были сделаны попытки получить антисыворотки, специфичные к аллотипам или аллельным вариантам Т-клеточных рецепторов. Это достигалось иммунизацией Igh-конгенных линий мышей активированными Т-клетками различных типов. Изучение свойств полученных антисывороток и моноклональных антител оказалось весьма плодотворным в двух отношениях. Во-первых, были получены новые данные, свидетельствующие в пользу участия генов иммуноглобулинов в образовании Т-клеточных рецепторов; во- вторых, результаты экспериментов позволили предположить, что различные функциональные классы Т-клеток предпочтительно экспрессируют рецепторы с определенными Т- клеточными аллотипами. Таким образом, рецепторы Т-клеток могут нести аллотипические детерминанты, которые, подобно аллотипам иммуноглобулинов, экспрессируются на структурно-различных константных областях, выполняющих разные функции . Изучение экспрессии детерминант данного типа на выделенных Т-клеточных факторах с разной функциональной активностью дало возможность предположить, что эти изотипические маркеры в действительности связаны с различными функциями Т-клеток, хотя такая связь может и не быть абсолютной.

Данные, указывающие на возможность существования многочисленных изотипов Т-клеточных рецепторов были получены с помощью моноклональных антител, индуцированных в опытах с конгенными мышами. Антитела одного такого типа связывались с четырьмя разными видами молекул Т-клеточной мембраны, которые, как и предполагалось, представляют собой изотипы Т- клеточных рецепторов, несущие различные аллельные маркеры. Эти четыре разновидности молекул были обозначены как Трге, Tthy, Tind и Tsu. Они кодируются генами, находящимися в коротком сегменте хромосомы 12 (IgT-C), расположенным между локусами, кодирующими Igh-1 и преальбумин, на расстоянии около двух сантиморганид от Igh-1 в сторону теломера. Существуют некоторые функциональные ограничения для экспрессии изотипов. Например, у цитотоксических и хелперных клеток эти антигены не экспрессируются, у клеток Lyt1-2- предпочтительно экспрессируются Tind, а у клеток Lytl"2+ — Tsu. Однако на уровне клонов эти ограничения не являются абсолютными. Можно найти отдельные клоны клеток Lyt-2, экспрессирующих Tind, или клеток Lyt-1, экспрессирующих Tsu. По-видимому, на поверхности регуляторных клеток могут экспрессироваться любые изотипы, но при клонировании у различных субпопуляций возникает предпочтение к определенным изотипам. В указанном районе хромосомы 12 может оказаться значительное количество еще не описанных изотипов. Многие Т- клетки не экспрессируют ни одной из этих детерминант. Не исключена и другая ситуация, когда некоторые субпопуляции Т-клеток экспрессируют рецепторы других типов, кодируемые где-либо в другом месте генома.

Экспрессия Т-клеточных изотипов может иметь некоторые общие черты с экспрессией В-клеточных изотипов. Порядок появления изотипов в иммуно- компетентных клетках коррелирует с порядком их появления в период онтогенеза: Трге — самый ранний поверхностный маркер, Tthy обнаруживается в течение непродолжительного времени после рождения, Tind появляется между 2-м и 3-м, a Tsu — между 5-м и 6-м днями. В том же порядке эти маркеры экспрессируются при развитии Т-клетки. Приведенные факты наводят на мысль о комплексе генов, организованных аналогично генам константной части иммуноглобулинов, где порядок экспрессии изотипов при созревании и в период онтогенеза соответствует порядку генов в хромосоме. Генетическая карта района IgT-C представлена на рисунке.

Схематическое изображение участка мышиной хромосомы 12 от гена Lyb-1 до гена, кодирующего преальбумин  
(Pre).

Показано расположение кластеров генов Igh-V, Igh-C и IgT-C, а также расстояния по карте между маркерными локусами.

То, что эти антитела действительно реагируют с антигенсвязывающими белками, было продемонстрировано в нескольких исследованиях. Во-первых, выяснилось, что эти антитела блокируют связывание идиотипа специфическими к данному идиотипу Т-супрессорами. Во-вторых, некоторые из этих антител реагируют с аффинно-очищенными антигенсвязывающими молекулами из клонированных Т-клеток и (или) Т-клеточных гибридов. В-третьих, было показано, что эти антитела могут быть использованы для очистки специфических анти- генсвязывающих факторов супрессии и амплификации. Кроме того, они применяются для очистки антигенсвязывающей полипептидной цепи фактора супрессии, который образуется in vitro при трансляции соответствующей мРНК. Наличие у данных антител описанных свойств служит убедительным доводом в пользу идеи, согласно которой вблизи от группы генов Igh находится участок, кодирующий некий фрагмент Т-клеточного рецептора Эти антитела могут оказаться пригодными при изучении зависимости между структурами Т-клеточных изотипов и функцией соответствующих субпопуляций Т-клеток.

Другой способ получения антисывороток против антигенсвязывающих молекул Т-клеточного происхождения — это выделение таких молекул с помощью аффинной хроматографии и их использование для иммунизации животных других видов. Подобные гетероантитела выделены уже в нескольких лабораториях, и полученные с их помощью результаты в нескольких случаях были проверены в перекрестных опытах. Такие антисыворотки осаждают в основном молекулы с мол. массой 68 ООО Да; при этом обнаруживается полный иммунологический перекрест. Многие из сывороток реагируют со значительной частью периферических Т-клеток и слабо взаимодействуют с тимоцитами. Такие сыворотки могут быть использованы для разделения или классификации Т-клеточных изотипов, не обнаруживаемых с помощью моноклональных антител, а также препаративного выделения Т-клеточных антигенсвязывающих молекул. Недостаток данных сывороток заключается в необходимости постоянно и тщательно контролировать их специфичность в течение всего времени приготовления, так что по надежности они уступают аналогичным моноклональным антителам. С другой стороны, подобные гетероантисыворотки узнают детерминанты, общие для всех линий мышей и крыс, в то время как получение моноклональных антител к этим детерминантам затруднено, за исключением, быть может, случаев, когда производится иммунизация Т- клетками бестимусных (nude) мышей. Поэтому с помощью таких сывороток можно получить информацию, недоступную нам при работе с моноклональными антителами.

Результаты некоторых исследований наводят на мысль, что в узнаваемых структурах на поверхности Т-клеток могут присутствовать фрагменты, кодируемые генами МНС. В одном из примеров было показано, что полипептид с мол. массой 25 ООО Да, выделенный из определенного клона, связывает антиген, а также имеет идиотипическую детерминанту и антигенные детерминанты, кодируемые генами I-J. Характерен ли этот полипептид только для данного клона или же он имеется и у нормальных клеток, в настоящее время пока не ясно. В другом случае фактор, секретируемый индукторами супрессии по типу обратной связи, имел антигенные детерминанты, кодируемые участками, расположенными как в хромосоме 12, так и в хромосоме 17 (I-J). Поскольку у молекул, продуцируемых Т-клетками радиационных химер, ни один из маркеров не изменен, при том, что во фрагменте данной полипептидной цепи, отвечающем за узнавание собственных антигенов, есть изменения, существует предположение, что этот полипептид образован продуктами двух несцепленных между собой генов. Каким образом это достигается, неизвестно. Очевидно лишь одно: для выяснения механизмов образования таких молекул необходимо более детальное изучение их структуры и молекулярно- генетических аспектов их синтеза.

Наконец, имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что продукты генов Lyt-2, по-видимому, принимают участие в узнавании Т-клеток, поскольку антитела против Lyt-2 могут блокировать функцию цитотоксических эффектор- ных клеток. Хотя гены Lyt-2, по-видимому, недостаточно вариабельны, чтобы обеспечить возможность распознавания индивидуальных антигенов, они тем не менее могли бы определять структуру каких-либо инвариантных частей рецептора. С другой стороны, не исключено, что продукт гена Lyt-2 необходим лишь для функционирования рецепторов и не принимает участия в узнавании. То, что ген Lyt-2 локализован очень близко к группе генов х-легкой цепи в хромосоме 6, а также то, что гены Трге, Tthy, Tind и Tsu расположены в хромосоме 12 близко к Igh, может оказаться существенным. Тот факт, что гены λ-легкой цепи располагаются в хромосоме 16, в большей части которой не обнаружено известных генетических маркеров, вызывает естественный вопрос: а не может ли быть, что хромосома 16 кодирует еще не идентифицированные Т-клеточные антигенсвязывающие молекулы?

Из серологических исследований стало очевидным, что есть очень много вопросов, на которые мы не можем дать окончательный ответ. Проблема осложнилась еще более, когда выяснилось, что покоящиеся клетки и Т-клеточные гибридомы образуют очень мало антигенсвязывающих молекул в расчете на одну клетку. Ранние данные по структуре иммуноглобулинов в большинстве случаев были получены при изучении миеломных белков, а более поздние данные — при изучении моноклональных иммуноглобулинов, секретируемых клетками гибридных линий. Миеломные Т-клеточные линии неизвестны, а Т-клеточные гибриды секретируют не намного больше антигенсвязывающих молекул, чем покоящиеся клетки. Это, однако, не означает, что Т-клетки не могут секретировать факторы в больших количествах. Необходимы более совершенные методы идентификации и количественной оценки клеточных продуктов. Вероятно, имеет смысл осуществить получение моноклональных антирецепторных антител с помощью конгенных мышей и крыс (поскольку это позволит как охарактеризовать соответствующие молекулы, так и обнаружить их в системе трансляции in vitro) и исследовать клеточные популяции, экспрессирующие или секретирующие эти молекулы, что в целом даст возможность сопоставить данные молекулярной генетики с функцией разных клеток при сложных иммунных ответах. Различные антисыворотки и моноклональные антитела, которые, как предполагается, реагируют с Т-клеточными рецепторами или влияют на функцию Т-клеток, приведены в таблице.

Антитела против предполагаемых Т-клеточных рецепторов г)

Антисыворотки или антитела Взаимодействие с Т-клетками или их продуктами Генетическое сцепление Осаждаемые молекулы
Антиидиотипические антитела      
Анти-(Льюис-анти-DА) Lewis Т-клетки, аллореактивные по отношению к DA Igh 70 (45, 25)
Анти-НФb-(М) НФ-связывающие молекулы, выделенные из Т-клеток Igh-V 150 (75)
Анти-Т15 (М) ФА-специфические Th- и Тотн-клетки Igh-V  
Анти-А5А А-СНО-специфические Th-клетки Igh  
Анти-Nase Nase-специфические Th-клетки Igh-V  
Анти-(СВА анти-В6) СВА-Т-клетки, аллореактивные по отношению к Н-2b Igh  
Анти-(В6 анти-SJL) В6 Т-клетки, аллореактивные по отношению к H-2S Igh+MHC 75 (62, 50)
Антитела против мышечных антител к эритроцитам барана Специфический TsF эритроцитов барана и Ly2-розетки эритроцитов барана Нет 68 (45, 25)
Анти-А-анти-В6АР1 Пролиферирующие клоны А-анти-BGAF1-клеток ?  
Aнти-(B6-aHTH-H-2d клон) (М) Клоны Dd-cпецифических цитотоксических эффекторных Т-клеток ?  
Антитела к каркасной части вариабельной области антител      
Анти-VH Т-хелперы, фактор индукции, факторы супрессии, молекулы из НФ-связывающих Т-клеток Igh-V  
Анти-VL 0 Igλ-V  
Аллотипические антитела против Т-клеток      
Анти-Тpre (М) Пре-Т-клетки IgT-C  
Анти-Ттhy (М) Пролиферирующие тимоциты IgT-C 75
Анти-Tsu (М) Супрессорные Т-клетки; блокируют идиотипическое связывание IgT-C 65
Анти-Tind (М) Индукторные Т-клетки IgT-C 62
BALB/c-анти-С В.20 (М) Антиген-специфические супрессорные клетки, TsF Igh 68
BALB/c-анти-С, В20 (М) Т-амплификаторы, TaF Igh  
Кроличьи анти-(СВА-анти-В6)-антитела СВА-клетки-Ly1 (Iа-реактивные) Igh 75
Гетерологичные антисыворотки против Т-клеточных рецепторов      
Кроличьи анти-(Льюис-анти-ВА)-антитела Т-клетки, идиотипы Т-клеточного происхождения, TsF (мышь и крыса) Нет 65 (45, 25)
Баранья антисыворотка против мышиных TsF-бараньи эритроциты Антигенсвязывающие белки Т-клеточного происхождения, TsF (из мыши и крысы) » 65 (45, 25)
Кроличьи анти-TNP-TsF Т-клетки, антигенсвязывающие белки Т-клеточного происхождения (из мыши и крысы) » 65 (45, 25)
Аллоантитела   I-J 33, 34
Анти-I-J (М) Т-клетки, различные факторы Т-клеточного происхождения I-A 33, 35
Анти-I-At (М) Т-амплификаторы, Taf Lyt-2  
Анти-Lyt-2 (М) Супрессорные Т-клетки, цитотоксические Т-клетки, аллогенные Т-хелперы; блокируют функционирование Т-клеток IgК